НОУ ИНТУИТ | Интеллектуальные сенсоры. Лекция 23: Принципы работы ППР-сенсоров. Промышленные ППР-сенсоры

Учитесь и получайте официальные документы БЕСПЛАТНО. Вы можете поддержать наш проект.

Регистрация Вход

Твой путь к знаниям!

Опубликован: 26.05.2010 | Доступ: свободный | Студентов: 1593 / 255 | Оценка: 4.42 / 4.25 | Длительность: 56:51:00

ISBN: 978-5-9963-0124-9

Темы: Искусственный интеллект и робототехника, Аппаратное обеспечение

Специальности: Разработчик аппаратуры

|

Вам нравится? Нравится 35 студентам

| Поделиться |

Поддержать курс

| Скачать электронную книгу

Ответы

Ответы на вопросы

1. Сокращение "ППР" расшифровывается как "поверхностный плазмонный резонанс".

2. Явление поверхностного плазмонного резонанса проявляется в том, что при отражении плоскополяризованного света от металлической пленки при определенном угле отражения (или при определенной длине волны) коэффициент отражения резко уменьшается, поскольку энергия света расходуется на возбуждение поверхностных плазмонов в металле. "Кривая ППР" – это график зависимости интенсивности отраженного металлической пленкой света от угла отражения или от длины волны (частоты) света.

3. Отраженный от металлической пленки свет "чувствует" свойства среды, находящейся по другую сторону пленки, в том случае, если металлическая пленка достаточно тонка, и значительная часть затухающей в металле электромагнитной волны достигает противоположной поверхности металла.

4. "Рецепторный слой" на чувствительной поверхности ППР сенсора представляет собой осажденный биохимическими методами ("иммобилизованный") мономолекулярный слой "лиганда" или "рецептора". Он избирательно взаимодействует с "аналитом" – теми молекулами (частицами), концентрацию которых в растворе мы хотим измерять.

5. "ППР биосенсор" – это ППР сенсор, в котором в качестве "рецептора" используются молекулы или частицы биологического происхождения.

6. "ППР иммуносенсор" – это ППР сенсор, в котором в качестве "рецептора" используются природные антитела. Они выделяются из живых организмов, где вырабатываются их иммунной системой для противодействия токсинам.

7. Чтобы определить концентрацию аналита в ППР сенсоре, надо измерить вызываемый им сдвиг кривой ППР. В сенсоре, использующем монохроматический свет, это – угловой сдвиг. В сенсоре, использующем свет непрерывного спектра, это – спектральный сдвиг (по длине волны или по частоте).

8. Можно назвать следующие области применения ППР биосенсоров: научные исследования в области биохимии, биотехнологии, вирусологии, иммунологии, онкологии; обнаружение опасных загрязнений, отравляющих и химически вредных примесей, в частности, быстрое обнаружение вирусов, бактерий, вредных биохимических веществ в питьевой воде, контроль концентрации разных ингредиентов в молоке, пиве, вине, других напитках, в бензине, моторных маслах и т.п.

9. Можно назвать следующие типы промышленных ППР сенсоров: "BIACORE 3000" шведской фирмы Biacore AB, SR7000 фирмы Reichert Analytical Instruments, SPRimager $\text{\textregistered}$ II, "Плазмон - 5", интегральный оптоэлектронный ППР модуль MISL.

10. Единица измерения 1 RU – это специально введенная единица (resonance unit – единица резонанса), означающая сдвиг кривой ППР, вызываемый связыванием 1 пикограмма (10^–15 кг) протеина на 1 мм² чувствительной поверхности.

11. "Сенсограмма" – это график зависимости от времени положения минимума ППР, снимаемый в ходе изучения химического взаимодействия аналита с лигандом.

12. "Групповой рецепторный чип" – это обычно стеклянная пластина, на которой сформирован целый массив островков из тонкой пленки золота с осажденным на неё мономолекулярным слоем протеина. С помощью микропипетки на каждый островок можно нанести микрокаплю соответствующего раствора и иммобилизовать из него на слой протеина свой лиганд. На таком "чипе" можно одновременно исследовать взаимодействие пробы с аналитом со многими осажденными лигандами.

Ответы к упражнениям

Упражнение 23.1.

Вариант 1. "Поверхностные плазмоны" – это волны переменной плотности электрического заряда, которые могут возникать и распространяться в электронной плазме металла вдоль его поверхности или вдоль тонкой металлической пленки. Оказалось, что поверхностные плазмоны могут возбуждаться под воздействием поляризованного света, если поляризация его такова, что электрический вектор электромагнитной волны лежит в плоскости падения, и проекция волнового вектора фотонов света на плоскость пленки равна волновому вектору поверхностного плазмона. "Геометрия Кречмана" – это разработанная Кречманом оптическая схема наблюдения ППР, при которой монохроматический свет падает на пленку металла из оптически прозрачной среды (например, из стекла) с относительно большим показателем преломления под углом, больше угла полного внутреннего отражения. ППР наблюдается как резкое падение интенсивности отраженного света при определенном ("резонансном") угле отражения.

Вариант 2. Формула, определяющая условие поверхностного плазмонного резонанса, имеет следующий вид:

$\frac{2\pi}{\lambda}n_C\sin\theta=k_{\textit{ПП}}\sqrt{\frac{\varepsilon_M n^2}{\varepsilon_M+n^2}}.$

Здесь $\lambda$ – длина волны света; n_C

– показатель преломления среды, из которой на металл падает свет и на поверхности которой находится металлическая пленка (обычно стекла); $\theta$ – угол падения света на металлическую пленку; $k_{\textit{ПП}}$ – волновой вектор поверхностного плазмона данной металлической пленки; $\varepsilon_M$ – модуль комплексной диэлектрической проницаемости этого металла;

– показатель преломления среды, которая находится на противоположной стороне металлической пленки. Как известно, n^2

равен диэлектрической постоянной этой среды.

Вариант 3. Поверхностный плазмонный резонанс в зависимости интенсивности отраженного света от угла отражения наблюдается при условии, что падающий на металлическую пленку свет является монохроматическим. Поверхностный плазмонный резонанс в зависимости интенсивности отраженного света от длины волны наблюдается при условии, что поляризованный свет падает на металлическую пленку под фиксированным углом и имеет непрерывный спектр. Эти зависимости эквивалентны по своей информационной способности. Больше информации можно извлечь из той, которая позволяет точнее измерять сдвиги кривой ППР при воздействии одного и того же количества аналита.

Вариант 4. ППР сенсор становится избирательно чувствительным к определенным молекулам, биологическим примесям или частицам только тогда, когда на металлическую пленку иммобилизиван рецепторный слой (лиганд), избирательно чувствительный к соответствующим молекулам, биологическим примесям или частицам. Концентрация соответствующих частиц в контролируемой среде может быть определена по сдвигу кривой ППР. Чем выше концентрация, тем больше частиц (при прочих равных условиях) присоединяется к лиганду, и тем больше наблюдаемый сдвиг кривой ППР.

Вариант 5. Под "чувствительностью" ППР сенсора понимают ту минимальную концентрацию аналита, которую может надежно зафиксировать ППР сенсор. Она определяется, в первую очередь, тем минимальным углом сдвига кривой ППР, которую может зафиксировать ППР сенсор. А этот угол зависит от применяемых в сенсоре программно-технических средств. Но "чувствительность" зависит также и от условий проведения измерений. Ведь сдвиг кривой ППР определяется не тем, сколько частиц аналита имеется в пробе, а тем, сколько из них химически связалось с лигандом. А это зависит от температуры и от времени взаимодействия пробы с лигандом.

Вариант 6. "Физическая" разрешающая способность ППР сенсора – это тот минимальный угол, который позволяет различать "физическая" структура ППР сенсора. Измерить сдвиг одной точки кривой ППР можно с точностью, не превышающей этот минимальный угол. Но можно воспользоваться тем, что область минимума кривой ППР сдвигается как единое целое. Если измерить положения одновременно многих, например 50 точек кривой ППР, то посредством математической обработки результатов сдвиг кривой ППР как целого можно вычислить с намного большей точностью. Это – своего рода обобщение давно известного в физике принципа "нониуса". Т.о., с помощью программных средств "физическую" разрешающую способность ППР сенсора можно существенно улучшить.

Вариант 7. Формула, определяющая физическую угловую разрешающую способность ППР сенсора в оптической схеме с параллельным пучком света, имеет следующий вид:

$\Delta\theta=\frac{s}{f}+\frac{\Delta\lambda}{\lambda}\tg\theta.$

Здесь – размер излучающей области источника света; – фокусное расстояние коллимационной линзы; $\lambda$ и $\Delta\lambda$ – длина волны и полуширина спектральной полосы излучения; $\theta$ – угол, под которым наблюдается ППР.

Вариант 8. Формула, определяющая физическую угловую разрешающую способность ППР сенсора в оптической схеме с расходящимся пучком света, имеет следующий вид:

$\Delta\theta_P=\frac{s_{\textit{Ф}}}{L}+\frac{\Delta\lambda}{\lambda}\tg\theta.$

Здесь $s_{\textit{Ф}}}$ – размер отдельного фотодетектора в плоскости отражения;

– полный путь, который проходит свет от вершины расходящегося конуса света до линейки фотодетекторов; $\lambda$ и $\Delta\lambda$ – длина волны и полуширина спектральной полосы излучения; $\theta$ – угол, под которым наблюдается ППР.

Упражнение 23.2.

Вариант 1. Из формулы (23.1) следует, что при неизменных условиях на внешней стороне металлической пленки величина $(n_C\sin\theta)/\lambda$ должна остаться неизменной. Т.е. должно выполняться условие $(n_C\sin\theta)/\lambda = (n_{C1}\sin\theta_1)/\lambda_1$ , где $n_{C1}, \theta_1, \lambda_1$ – изменившиеся значения параметров. Если использовать стеклянную подложку с показателем преломления $n_{C1}$ = 1,54 при неизменной длине волны света, то резонанс должен наблюдаться при угле, для которого выполняется условие: $1,48 \sin 64^{\circ} = 1,54 \sin \theta_1$ . Отсюда $\sin \theta_1 = 0,86378$ и $\theta_1 = 59,74^{\circ}$ .

Вариант 2. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $1,48/630 = 1,54/\lambda_1$ . Отсюда $\lambda_1$ = 655,5 нм.

Вариант 3. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $1,48 \sin 64^{\circ} = n_{C1} \sin 60^{\circ}$ . Отсюда $n_{C1}$ = 1,774.

Вариант 4. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $(\sin 64^{\circ})/630 = (\sin\theta_1)/680$ . Отсюда $\sin\theta_1 = 0,9701$ и $\sin\theta_1 = 76^{\circ}$ .

Вариант 5. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $(\sin 64^{\circ})/630 = (\sin 62^{\circ})/\lambda_1$ . Отсюда $\lambda_1$ = 618,9 нм.

Вариант 6. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $1,48/630 = n_{C1}/680$ . Отсюда $n_{C1}$ = 1,597.

Вариант 7. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $(1,48 \sin 64^{\circ})/630 = (n_{C1}\sin 68^{\circ})/730$ . Отсюда $n_{C1}$ = 1,66.

Вариант 8. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $(1,48 \sin 64^{\circ})/630 = (1,54 \sin 62^{\circ})/\lambda_1$ . Отсюда $\lambda_1$ = 644 нм.

Вариант 9. Используя условие, выведенное в варианте 1, получаем для конкретных условий задачи соотношение: $(1,48 \sin 64^{\circ})/630 = (1,54 \sin \theta_1)/680$ . Отсюда $\sin \theta_1 = 0,9323$ и $\theta_1$ = 68,8 $\deg$ .

Упражнение 23.3.

Вариант 1. Используя формулу (23.2) и подставляя в неё данные задачи, находим: $\alpha = 180^{\circ}\times 0,2/(\pi\times 25) \approx 0,46^{\circ}$ .

Вариант 2. Подставляя в формулу (23.2) данные задачи, получаем: $0,5^{\circ} = 180^{\circ}\times 0,3/(\pi f)$ . Отсюда $f = 180^{\circ}\times 0,3/(\pi\times 0,5) \approx 34,4 \text{ мм}$ .

Вариант 3. $\alpha = 180^{\circ}\times 0,002/(\pi\times *25) \approx 0,005^{circ} \approx 17 \text{ угл. секунд}$ .

Вариант 4. Подставляя данные задачи в формулу (23.6), находим: $\Delta\theta = 0,3/36 + 16 \tg 64^{\circ}/750^{\circ} \approx 0,0521 \text{ (радиан) |\approx 3^{\circ}$ .

Вариант 5. Подставляя данные задачи в формулу (23.6), находим: $\Delta\theta = 0,002/25 + \tg 62^{\circ}/630 \approx 0,0031 \text{ (радиан) }\approx 0,18^{\circ}$ .

Вариант 6. Подставляя данные задачи в формулу (23.8), находим: $\Delta\theta = 0,015/70 + \tg 62^{\circ}/780 \approx 0,00263 \text{ (радиан) } \approx 0,15^{\circ}$ .

Вариант 7. Подставляя данные задачи в формулу (23.8), находим: $\Delta\theta = 0,03/60 + 16 \tg 64^{\circ}/750 \approx 0,00442 \text{ (радиан) }\approx 2,5^{\circ}$ .

Упражнение 23.4.

Вариант 1. В ППР сенсоре "BIACORE 3000" шведской фирмы Biacore AB имеются и одновременно могут быть задействованы 4 проточных канала измерений. Результаты, полученные от канала сравнения, могут автоматически вычитаться из результатов, получаемых в других каналах, что позволяет повысить разрешающую способность и информативность каждого анализа. В оптимальных условиях проведения экспериментов BIACORE 3000 позволяет зафиксировать сдвиг резонансного угла от 10 RU до 70000 RU. Чувствительность анализов достигает 1 пМ = 10^–12 моля. Допустимый диапазон изменения показателя преломления исследуемой жидкости – от 1,33 до 1,40. Имеются возможности автоматической загрузки исследуемых образцов, точной автоматической инжекции проб, регулирования скорости потока от 1 до 100 мкл/мин. Для проведения эксперимента и регистрации сигналов связывания во всех 4 каналах хватает лишь 1 мкл раствора. Это позволяет экономить очень ценные реактивы. Специальное программное обеспечение позволяет автоматически проводить заданные процессы иммобилизации белков на поверхности металлической пленки, исследовать как отдельные образцы, так и осуществлять серии исследований с автоматической сменой растворов или/и образцов, выполнять детальную обработку результатов, вычислять все нужные пользователю показатели кинетики биохимических реакций. С помощью сенсора Biacore 3000 можно изучать как малые молекулы, начиная от молекулярной массы 180 а.е.м., так и большие клетки, бактерии, антитела. Но аппаратура достаточно громоздка – до 50 кг. И дорогостоящая.

Вариант 2. Для проведения биохимических или химических исследований с помощью методик ППР на чувствительную поверхность ППР сенсора устанавливают специальную проточную ячейку, которая через патрубки присоединяется к системе регулирования потока исследуемой жидкости с использованием перистальтического насоса и инжекционного клапана. Поскольку проточная ячейка и патрубки очень тонкие (для экономии дорогостоящих препаратов), все жидкости должны быть профильтрованы сквозь 0,2 мкм фильтр и тщательно дегазированы. Вся проточная система должна регулярно промываться специальными растворами. Перед исследованиями обычно проводят подготовительный цикл. В этом цикле через проточную ячейку прокачивается сначала раствор протеина, который оседает мономолекулярным слоем на поверхность золотой пленки. Потом прокачивают раствор тех биохимических молекул или антител, взаимодействие которых с молекулами или частицами аналита нужно изучить. Они присоединяются к протеину и образуют биорецепторный слой (лиганд). Эта процедура может длиться 1...2 ч. В цикле измерений проточная ячейка и чувствительная поверхность сначала промываются несколько минут буферным раствором (фаза І). Потом через ячейку прокачивается заданный объем жидкости с исследуемым аналитом, и начинается измерение (фаза ІІ). Кривую ППР измеряют многократно, каждый раз рассчитывая точное текущее положение минимума ППР, и строят график его зависимости от времени – "сенсограмму". Кинетика нарастания сдвига минимума ППР отображает кинетику химических реакций присоединения аналита к лиганду. В ходе следующей фазы (ІІІ) инжекция аналита прекращается, но продолжается прокачка чистой жидкости. Процессы присоединения практически прекращаются, идут лишь процессы диссоциации. Ход кривой на этой стадии позволяет вычислить константы этого процесса. А зная их, по результатам измерений в фазе ІІ можно вычислить и константы реакции присоединения. В фазе ІV через ячейку прокачивается раствор элюента, который, резко ослабляя химическую связь аналита с лигандом, постепенно "вымывает" аналит, практически не влияя на лиганд. И происходит регенерация биочувствительной поверхности, в ходе которой положение минимума ППР должно возвратиться к первоначальному. После этого можно начинать новый цикл измерений. Практически удается провести свыше 50 разных исследований с одним и тем же аналитом.

Вариант 3. В ППР сенсоре SR7000 фирмы Reichert Analytical Instruments используется расходящийся световой пучок и линейка фотодетекторов, которые обеспечивают наблюдение ППР в пределах углов отражения от 58,5 до 85 $\deg$ . Оптическая призма выполнена из сапфира с показателем преломления 1,76. Чувствительный элемент на стеклянной подложке с показателем преломления 1,51 оптически соединен с призмой через тонкий слой иммерсионной жидкости. Сенсор SR7000 значительно меньше, чем BIACORE 3000, дешевле. Но и возможности его меньше.

Вариант 4. Оптоэлектронный ППР модуль MISL изготавливают с применением микросистемных технологий. На основе из кремния сформировано плоское миниатюрное зеркало, которое под действием электростатических сил может в пределах 10-20 $\deg$ вращаться вокруг оси, закрепленной на его приводе. В рабочем слое кремния сформированы также линейка фотодетекторов с микросхемами усиления и селекции сигналов и микросхема управления приводом зеркала. Над ними сформирован слой стекла, на поверхность которого нанесена тонкая пленка из золота. На ней формируется рецепторный слой, чувствительный к частицам аналита. На рецепторный слой устанавливают миниатюрную проточную ячейку. К модулю подведено оптическое волокно, возле торца которого установлены коллимационная микролинза и микропризма. Через оптическое волокно поступает монохроматический поляризованный свет. Микролинза формирует из него параллельный световой пучок, который отклоняется микропризмой на нужный угол и падает на зеркало. От зеркала свет попадает на чувствительную поверхность сенсора, а после отражения от нее – на линейку фотодетекторов. Размеры модуля в сборе приблизительно 20x10x2 мм.

Вариант 5. В ППР сенсоре SPRimager®II используется инфракрасный Фурье-спектрометр. Кривые ППР наблюдаются при фиксированном угле отражения в виде зависимости интенсивности отраженного света от волнового числа. Наилучшая разрешающая способность достигается в БИК свете с непрерывным спектром. Угол наблюдения можно изменять в пределах от 40 до 70 $\deg$ . Полученные изображения могут сохраняться в компьютере для демонстраций и обработки. Сенсор спроектирован так, что в одной проточной ячейке может исследоваться одновременно целый массив разных проб.

Вариант 6. ППР спектрометр "Плазмон - 5", созданный в Институте физики полупроводников им. В.Е. Лашкарёва НАН Украины, работает со сменными биочипами, на которые нанесена золотая пленка толщиной 45 нм. Источником монохроматического света (670 нм) служит GаАs лазер. Используется параллельный пучок поляризованного света. Кривые ППР снимаются путем точного механического поворота ретропризмы в пределах 17 $\deg$ . Работой прибора управляет персональный компьютер, который также обрабатывает результаты измерений. Габариты прибора 220x125x95 мм, масса 2,8 кг.

Дальше >>

Авторизоваться

Интеллектуальные сенсоры

Принципы работы ППР-сенсоров. Промышленные ППР-сенсоры

Ответы

Ответы на вопросы

Ответы к упражнениям

Вопросы и ответы