Сенсоры с люминесцентными маркерами. Биолюминесцентные и сцинтилляционные сенсоры

Упражнение 22.2.

Вариант 1. В сенсорах с люминесцентными маркерами "распознавателем" называют то звено макромолекулы, которое предназначено для "узнавания" и химического связывания молекулы-аналита. "Сигнализатором" называют звено этой макромолекулы, способное к люминесценции под действием внешнего света или другого возбуждающего фактора. В составе макромолекулы они взаимодействуют между собой так, что, когда "распознаватель" химически связывает молекулу-аналит, то это приводит к гашению или, наоборот, к стимулированию люминесценции сигнализатора. И сенсор, измеряя интенсивность люминесценции, определяет по ее изменениям наличие и концентрацию аналита.

Вариант 2. Применение встроенного микрокомпьютера в сенсорах с люминесцентными маркерами дает следующие преимущества. Микрокомпьютер может учесть нелинейность зависимости интенсивности люминесценции от концентрации аналита, а также влияние фактических изменений температуры, кислотности среды и других факторов, от которых (кроме концентрации аналита) тоже может зависеть интенсивность люминесценции. Наличие внутренней памяти позволяет такому сенсору отследить и сохранять в памяти динамику изменения интенсивности люминесценции, а, следовательно, и концентрации аналита со временем. Микрокомпьютер может сделать из этого определенные диагностические выводы, рассчитать кинетические характеристики и сигнализировать о возникновении критических ситуаций.

Вариант 3. Люминесцентный пластиковый глюкосенсор, предназначенный для определения содержания глюкозы в глазной жидкости, устроен следующим образом. Он имеет такие состав, размеры и форму, что его легко носить как контактную линзу в глазу. На периферию этого пластикового глюкосенсора нанесены специально синтезированные люминесцентные маркеры, которые, взаимодействуя с молекулами глюкозы, становятся способны к флуоресценции. Если осветить этот сенсор синим или фиолетовым светом, то по интенсивности флуоресценции периферийной его части можно определить концентрацию глюкозы в глазной жидкости пациента. А это позволяет судить о средней за прошедшие сутки концентрации глюкозы в его крови.

Вариант 4. Волоконнооптический сенсор влажности с люминесцентным маркером устроен и работает следующим образом. На чувствительную зону оптического волокна наносят люминесцентный маркер, в состав которого входит "распознаватель" – специфически чувствительное к молекулам воды звено и "сигнализатор" (политетрафлуороэтилен). Благодаря такому объединению, интенсивность флуоресценции последнего стала зависимой от относительной влажности окружающего воздуха. Оптическое волокно с нанесенным люминесцентным маркером вводят внутрь контролируемой среды (в грунт, в ёмкость с зерном, в мешок с сахаром и т.п.) так, чтобы чувствительная зона оказалась в заданной точке. Через один торец в оптическое волокно вводят возбуждающий свет, который достигая чувствительной поверхности, возбуждает в ней флуоресценцию, а на другом конце измеряют ее интенсивность. По результатам измерений микрокомпьютер вычисляет влажность контролируемой среды. Оказалось возможным измерять относительную влажность воздуха внутри среды в диапазоне от 4 до 100% при 20 C с воспроизводимостью лучше 4%. Однако при быстром изменении влажности требуется определенное время для установления нового динамического равновесия. Требуемое время составляет 1,5 мин.

Вариант 5. "Оптический нос" с люминесцентными маркерами устроен следующим образом. Его основой является набор из десятков чувствительных участков, на каждый из которых нанесен свой люминесцентный маркер, настроенный на обнаружение конкретного химического вещества. Один чувствительный участок распознает и позволяет измерять, скажем, присутствие и концентрацию кислорода, другой – озона, третий – углекислоты, четвертый – аммиака, пятый – этилового спирта, шестой – метилового спирта и т.д. Распределение интенсивности флуоресценции по поверхности такого "биочипа" отображает "запах" – химический состав окружающей среды. Измеряя интенсивность люминесценции каждого из таких участков и обрабатывая эти данные, микрокомпьютер может выдать информацию о наличии и концентрации всех десятков-сотен контролируемых химических веществ, неусыпно следить за составом газовой среды, давать интерпретацию характерных комбинаций "запахов", предупреждать об опасных ситуациях.

Вариант 6. В сенсорах с люминесцентным маркером интенсивность свечения можно специально модулировать с тем, чтобы облегчить выделение слабых сигналов люминесценции из разнообразных посторонних световых помех. В биолюминесцентных сенсорах такой возможности нет. Второе существенное отличие состоит в том, что биолюминесцентный сенсор – это живая клетка. Поэтому в таких сенсорах надо обеспечивать условия для поддержания жизнедеятельности клеток. Люминесцентный маркер – это макромолекула, которая не требует жестких условий жизнеобеспечения. В этом состоят преимущества люминесцентных маркеров. Зато живые клетки биолюминесцентных сенсоров легко размножать в питательных средах. В то время, как макромолекулы люминесцентных маркеров надо искусственно синтезировать.

Упражнение 22.3.

Вариант 1. Биолюминесценция обусловлена свечением молекул некоторых белков, возникающим при их возбуждении в ходе происходящих в клетках биохимических реакций. Чаще всего за биолюминесценцию ответствен белок люцифераза. Для свечения он использует энергию, выделяемую при окислении небольшой органической молекулы – люциферина. Люцифераза служит специфическим катализатором реакции окисления, и часть освобождающейся при этом энергии излучает в виде биолюминесценции.

Вариант 2. Основными функциональными элементами биолюминесцентных клеток-сенсоров являются следующие белки: "распознаватель", "репрессор", "промотор", "синтезатор" и люцифераза. Белок-распознаватель "узнает" проникающий в клетку аналит и, связывая его, подает сигнал белку-репрессору, который до сих пор блокировал работу белка-промотора. Будучи разблокирован, промотор запускает в работу "синтезатор" – молекулу РНК, на которой синтезируются молекулы люциферина. Появившиеся молекулы люциферина в присутствии люциферазы окисляются, и в результате высвобождающейся энергии возникает биолюминесценция. При отсутствии аналита синтез люциферина блокирован, и клетка не светится. Возможен и противоположный вариант: пока частиц аналита нет, промотор свободен, синтез люциферина идёт, и люциферин постоянно светится. Но как только частицы аналита появляются, распознаватель сигнализирует об этом репрессору, который блокирует работу промотора, синтез люциферина прекращается, и биолюминесценция исчезает.

Вариант 3. Для получения биолюминесцентных клеток-сенсоров используют генную инженерию. Сначала в ДНК клетки встраивают гены, на которых закодированы синтез нужных белков – распознавателя, репрессора, промотора, синтезатора, люциферазы и люциферина. Эти гены выделяют из ДНК клеток, в которых они имеются от природы. Реконструированную ДНК методами генной инженерии "запускают в работу" по копированию. В результате появляется биолюминесцентная клетка с требуемыми свойствами. Дальше такие клетки размножают в специальной питательной среде.

Вариант 4. Биолюминесцентные сенсоры уступают сенсорам с люминесцентным маркером по двум пунктам. Свечение биолюминесцентных сенсоров является самопроизвольным, не модулированным. Поэтому его труднее наблюдать и измерять, чем излучение люминесцентных маркеров. Ведь последние светятся только под действием внешнего возбуждающего света, и, благодаря этому, их излучение может быть оптимальным образом модулировано. Используя синхронную демодуляцию, его легко выделить на фоне даже сильной внешней засветки. Второй пункт состоит в том, что биолюминесцентные сенсоры – это живые клетки, которым надо обеспечивать условия для длительного поддержания их жизнедеятельности. Люминесцентный маркер – это макромолекула, которая не требует жестких условий жизнеобеспечения.

Вариант 5. В качестве примеров биолюминесцентных сенсоров можно назвать такого рода сенсоры, реагирующие один – на появление мышьяка, другие – на присутствие антибиотиков ампициллинового и тетрациклинового рядов, третьи – на соли тяжелых металлов, четвертые – на ракетное топливо гептил (вредное для живых организмов) и т.д. В ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), кроме них, создан также биолюминесцентный сенсор, который обнаруживает появление в организме вещества, посредством которого "согласуют" свои действия болезнетворные бактерии. Появление такого вещества означает, что в организме накопилось достаточно бактерий, чтобы начать коллективную атаку на организм хозяина. По появлению этого вещества можно зафиксировать начало, "старт" инфекционного заболевания.

Упражнение 22.4.

Вариант 1. По материалам, из которых они изготовлены, различают следующие виды сцинтилляторов: неорганические, органические и пластиковые. По агрегатному состоянию различают твердые, жидкие и газообразные сцинтилляторы. Самые яркие вспышки дают монокристаллические неорганические сцинтилляторы. Из них чаще всего используют такие неорганические материалы, как NaI(Tl), ZnS(Ag), LiI(Eu) и др. Имея высокую плотность и тяжелые ядра в составе, они хорошо тормозят гамма-излучение, электроны, мюоны и тяжелые ионизирующие частицы. Однако у этих сцинтилляторов сравнительно велика длительность вспышек: порядка 250-1000 нс. Из органических сцинтилляторов чаще всего используются антрацен, нафталин, p-терфенил, стильбен. Они лишь в 2-3 раза уступают неорганическим кристаллам по яркости сцинтилляций, но зато имеют короткие времена вспышек: порядка единиц наносекунды. Имея в своем составе много атомов водорода, они хорошо тормозят нейтроны и протоны. Это способствует их использованию для наблюдения именно протонного и нейтронного излучения.

Вариант 2. В настоящее время стали широко применять пластиковые сцинтилляторы. В них в оптимальных пропорциях смешивают несколько функциональных компонент с полимеризующимся материалом. По такой технологии можно формировать сцинтилляторы любой геометрической формы и больших размеров. Примером пластиковых сцинтилляторов могут служить сцинтилляторы Bicron BC 400…416 американской компании BICRON. Они производятся на основе поливинилтолуола и обладают достаточно хорошими характеристиками: время вспышки 1 нс, интенсивность вспышек достигает 20-30% от наблюдаемых в NaI(Tl).

Вариант 3. В состав сцинтилляционного счетчика входят следующие основные функциональные узлы: сцинтиллятор, фотоприемник, усилитель, формирователь счетных импульсов, счетчик, дисплей, кнопки управления. Принцип его работы таков. Ионизирующее излучение (быстрые частицы, гамма-кванты, электроны и т.д.), пролетая сквозь сцинтиллятор, ионизирует и возбуждает электронные оболочки его атомов, вследствие чего возникают сцинтилляции. Фотоприёмник преобразует вспышки люминесценции в электрические импульсы, которые усиливаются в электронном усилителе. Формирователь счетных импульсов придает этим импульсам форму, удобную для подсчета их числа в счетчике. Число импульсов за фиксированный период времени характеризует интенсивность ионизирующего излучения. Значение интенсивности выводится на дисплей. Чем короче вспышка света и чем большее быстродействие имеют фотоприёмник и последующие электронные узлы, тем больше импульсов успевает подсчитать сцинтилляционный счетчик за единицу времени, тем шире диапазон измеряемых им интенсивностей ионизирующего излучения.

Вариант 4. Дело в том, что, чем больше энергия пролетающей сквозь сцинтиллятор частицы, тем больше ионизированных и возбужденных электронных оболочек атомов оставляет она на своем пути. И поэтому тем интенсивней вспышка люминесценции. Таким образом, измеряя интенсивность вспышки, можно определить энергию пролетевшей частицы. Для этого в состав сцинтилляционного детектора вводят аналого-цифровой преобразователь, формирующий и передающий в микрокомпьютер цифровой код, пропорциональный интенсивности наблюдаемой вспышки. В микрокомпьютере на основе этого каждой зарегистрированной частице ставится в соответствие её энергия. Накапливая в памяти статистику пролетающих частиц и их энергий, микрокомпьютер строит и выводит на дисплей энергетический спектр наблюдаемого излучения, т.е. распределение пролетевших частиц по их энергиям. Это открывает следующие возможности. По спектру наблюдаемого ионизирующего излучения во многих случаях можно идентифицировать природу его источника. Ведь каждый радиоактивный изотоп имеет свой энергетический спектр ионизирующего излучения. Излучение из ускорителей заряженных частиц, из ядерных реакторов разных типов тоже имеет свои характерные энергетические спектры. Микрокомпьютер может также автоматически рассортировать различные компоненты ионизирующего излучения по их энергиям или по источникам и выдать интенсивность каждого из них в отдельности.

Вариант 5. Более полувека, начиная от 30-х гг. ХХ в., для регистрации сцинтилляций в качестве фотоприёмников применялись в основном ФЭУ – фотоэлектронные умножители. За счет подаваемого на их электроды внешнего ускоряющего напряжения и очень малых собственных шумов в них достигаются высокая чувствительность, коэффициенты усиления до 106 и высокое быстродействие. Поэтому ФЭУ применяются и сейчас. В последние десятилетия в связи с быстрым развитием микроэлектронной технологии и существенным улучшением характеристик стали широко использовать и полупроводниковые фотоприёмники. Несколько уступая ФЭУ по предельной чувствительности, они имеют такое же быстродействие, значительно меньшие габариты и стоимость. Благодаря этому были созданы гораздо более компактные и надёжные сцинтилляционные детекторы.

Вариант 6. Координатно-чувствительные сцинтилляционные детекторы строятся из многих слоев. Каждый слой состоит из матрицы фотодетекторов и расположенной над ней пластины сцинтиллятора. Индивидуальные фотодетекторы воспринимают в основном лишь сцинтилляции, происходящие в прилегающем объёме сцинтиллятора, каждый – в своём. Снимаемая с матриц фотодетекторов последовательность сигналов содержит информацию о координатах, моментах времени и интенсивности происходящих сцинтилляций. Накопив в памяти большого объёма такую информацию, компьютер, исходя из неё, может довольно точно реконструировать треки пролетающих частиц, их энергетические характеристики, точки распада, рассеяния или соударения частиц. Могут быть подсчитаны и показаны на дисплее также пространственное распределение пролетающих ионизирующих частиц, распределение их по направлениям и т.д. Время сцинтилляции фиксируется с точностью порядка 1 нс, а координаты – с точностью порядка 10 мкм. С такой примерно точностью можно реконструировать и трек частицы. Если частица, например гамма-квант, движется сквозь сцинтиллятор со скоростью света, то за 1 нс она проходит путь в 30 см.

Вариант 7. Для того чтобы построить распределение пролетающих сквозь координатно-чувствительный сцинтилляционный детектор частиц по направлениям, надо зарегистрировать достаточно большое количество пролетающих частиц, реконструировать их треки, рассортировать их по направлениям пролета частиц и построить в заданном пользователем ракурсе их распределение по направлениям. Чтобы построить распределение по координатам входа в сцинтилляционный детектор, надо рассортировать зарегистрированные частицы по этим координатам. Чтобы построить распределение, например, по сечению пучка, выходящего из ускорителя, надо сориентировать поверхность сцинтилляционного детектора перпендикулярно направлению пучка. Накопив информацию о достаточно большом числе пролетающих частиц, можно рассортировать их по координатам точки входа в детектор и построить требуемое распределение. Если исследуемый пучок монохроматичен, то частицы, зарегистрированные с другими энергиями, можно отсеять, избавившись тем самым от сторонних помех.

Вариант 8. Астрофизики склонны к мысли, что вокруг каждой галактики существует огромное облако т.н. "темной материи". О её наличии свидетельствует пока только гравитационное воздействие на видимую материю. Из чего состоит "темная материя", – еще не известно. Предполагают, что она состоит из неизвестных нам пока электрически нейтральных массивных частиц, очень слабо взаимодействующих с веществом. Их назвали "вимп" (от англ. WIMP — weakly interacting massive particles ). Поскольку наша Солнечная система находится на периферии Млечного Пути, то вполне может соприкасаться с облаком вимпов. Если это облако неоднородно по плотности, то мы, находясь на Земле, вращающейся вокруг Солнца, можем в разных точках орбиты чувствовать то более сильный, то более слабый поток вимпов, с периодом один год. Большинство вимпов свободно проходят Землю насквозь. Конечно же, даже многокилометровая толща горы для них не помеха. Однако изредка вимпы всё же сталкиваются с атомными ядрами и вызывают вспышки света. Частота вызываемых сцинтилляций должна изменяться с периодом в 1 год. Итальянский Национальный институт ядерной физики построил подземную лабораторию глубоко в толще горы Гран-Сассо (Gran Sasso) примерно в 100 км от Рима. Благодаря природной экранировке (от поверхности ее отделяют полтора километра горных пород!), поток космических лучей в ней в миллион раз меньше, чем на поверхности Земли. Именно здесь и проводится многолетний эксперимент по обнаружению вимпов. И в 2000 г. физики этого института опубликовали сообщение о том, что с помошью сцинтилляционных детекторов NaI(Tl) они обнаружили годовые колебания интенсивности сцинтилляций. Эти результаты многими скептиками были поставлены под сомнение. Усовершенствовав аппаратуру и резко уменьшив влияние источников случайных погрешностей, исследователи с 2003 г. повторили эксперимент. Результаты повторных экспериментов показали еще более четкую синусоидальную зависимость частоты сцинтилляций с периодом ровно в 1 год. Регулярно повторяются максимумы 2 июня и минимумы в начале декабря каждого года. Авторы настаивают на том, что полученная зависимость – это результат взаимодействия с вимпами. Никакие другие известные источники излучений земного или космического происхождения не могут объяснить совокупность 3-х факторов: строго синусоидальная годовая периодичность с точной привязкой к дате, наблюдение сигнала только при низких энергиях и только в "однодетекторных" событиях. Например, потоки известных космических излучений вызывают сцинтилляции с разными энергиями и одновременно во многих детекторах, поскольку порождают т.н. "космические ливни". Хотя в интерпретации полученных результатов и остаются еще какие-то сомнения, не исключено, что интеллектуальный сцинтилляционный сенсор помог сделать важное открытие в физике элементарных частиц, астрофизике и в космологии.