Принципы работы ППР-сенсоров. Промышленные ППР-сенсоры

23.3. Промышленные ППР сенсоры

В табл. 23.1, взятой из работы [ [ 54 ] ], указаны названия многих интеллектуальных ППР сенсоров, которые промышленно выпускались в начале ХХІ в. Все они рассчитаны на реализацию нескольких методик анализа, нуждаются в небольших объемах пробы, большинство из них частично автоматизированы. Некоторые имеют несколько каналов для одновременного сопоставительного анализа нескольких проб.

Таблица 23.1. Перечень оптических ППР сенсоров, разработанных к началу ХХІ в

№ п/п	Фирма	Название ППР биосенсора	Источник информации
1	Biacore AB	BIACORE 1000, 2000, 3000	Biacore.com
2	Reichert Analytical Instruments, Inc.	SR7000	http://www.reichertai.com
3	Affinity Sensors	Iаsys, Iasys Plus, Iasys Auto+	Affinity-sensors.com
4	IBIS Technologies	IBIS I, IBIS II	Ibis-spr.nl
5	Nippon Laser Electronics	SPR670, SPR Cellia	Nle-lab.cojp/English/ZO-HOME.htm
6	Texas Instruments	Spreeta	ti.com/sc/docs/products/msp/control/spreeta
7	Analytical -Systems	BIO-SUPLAR 2	Micro-systems.de
8	AVIV Instruments	PWR Model 400	Avivinst.com
9	Farfield Sensors Ltd	AnaLight Bio250	farfield-sensors.co.uk
10	Luna Innovations	Fіber optic prototype	lunainnovations.com
11	ThreeFold Sensors	Label-free prototype	ic.net/~tfs
12	Graffinity	Plasmon Imager	Graffinity.com
13	Leica	Prototype	Leica-ead.com
14	Prolinx	OCTAVE	Prolinxinc.com
15	HTS Biosystems	SPR array	Htsbiosystems.com
16	Quantech Ltd	FasTraQ SPR array	quantechltd.com
17	SRU biosystems	BIND	Srubiosystems.com

Одним из наиболее известных ныне в мире промышленных ППР сенсоров является "BIACORE 3000" шведской фирмы Biacore AB, показанный на рис. 23.7 [ [ 64 ] , [ 83 ] ]. Он состоит из мини-компьютера и сенсорного блока размерами 760x610x350 мм и массой до 50 кг. Рассчитанный на стационарное использование в лабораториях, он является наиболее высокопроизводительной и чувствительной исследовательской системой для изучения взаимодействия биохимических веществ. Чувствительность анализов достигает 1 пМ = 10^–12 моля. Допустимый диапазон изменения показателя преломления исследуемой жидкости – от 1,33 до 1,40.

Рис. 23.7. Интеллектуальный ППР сенсор "Biacore 3000": слева – сенсорный блок, справа – общий вид

В оптимальных условиях проведения экспериментов BIACORE 3000 позволяет зафиксировать сдвиг резонансного угла от 10 RU до 70000 RU. Специально введенная единица 1 RU (resonance unit – единица резонанса) эквивалентна сдвигу, вызываемому связыванием 1 пикограмма (10^–15 кг) протеина на 1 мм² чувствительной поверхности. Способность регистрировать связывание биомолекул с такой высокой чувствительностью гарантирует надежность получаемых результатов и высокое качество их интерпретации. В системе параллельно работают и одновременно могут быть задействованы 4 проточных канала измерений. Результаты, полученные от канала сравнения, могут автоматически вычитаться из результатов, получаемых в других каналах, что позволяет повысить разрешающую способность и информативность каждого анализа.

Технические усовершенствования управляемой проточной системы обеспечили возможность автоматической загрузки исследуемых образцов, точную автоматическую инъекцию проб, регулирование скорости потока от 1 до 100 мкл/мин., минимальные затраты ценных реактивов. Для проведения эксперимента и регистрации сигналов связывания во всех 4 каналах хватает лишь 1 мкл раствора. Малый объем проточного канала 0,02 мкл свел потери к минимуму. Специальное программное обеспечение позволяет автоматически проводить заданные процессы иммобилизации белков на поверхности металлической пленки, исследовать как отдельные образцы, так и осуществлять серии исследований с автоматической сменой растворов или/и образцов, выполнять детальную обработку результатов, вычислять все нужные пользователю показатели кинетики биохимических реакций. Имеется, например, и программа моделирования взаимодействий, которая позволяет еще до загрузки реальных образцов оптимизировать условия и последовательность проведения экспериментов с ними.

С помощью сенсора Biacore 3000 можно изучать как малые молекулы, начиная от молекулярной массы 180 а.е.м., так и большие клетки, бактерии, антитела, и находить ответы на такие, например, вопросы, как:

• насколько специфическим является связь между молекулами (клетками) двух данных видов?
• с какой скоростью происходит их связывание?
• насколько сильной является их связь?
• при каких условиях можно её разорвать?
• как влияют температура, кислотность, концентрация, вид растворителя или третье вещество (фермент, катализатор, антитело) на ход реакций их связывания?

Поэтому эта система и подобные ей широко используются для исследований функций отдельных белков и других биохимических веществ, молекулярного распознавания, для исследований и анализов в областях иммунологии, онкологии, вирусологии, инфекционных заболеваний, биотехнологии и др. Многочисленные применения такого типа ППР сенсоров описаны в сотнях работ. Сошлемся лишь на одну из них [ [ 328 ] ], где показана эффективность метода ППР для регистрации и изучения ферментативных реакций при участии NADH и NADPH, которые сыграют важную роль в биохимии.

Типичной технологией применения является следующая (см., например, [ [ 54 ] , [ 152 ] ]). На чувствительную поверхность ППР сенсора устанавливают специальную проточную ячейку (flow cell), которая через патрубки присоединяется к системе регулирования потока исследуемой жидкости с использованием перистальтического насоса и инъекционного клапана. Поскольку проточная ячейка и патрубки очень тонкие (для экономии дорогостоящих препаратов), все жидкости должны быть профильтрованы сквозь 0,2 мкм фильтр и тщательно дегазированы. Вся проточная система должна регулярно промываться специальными растворами.

При биохимических исследованиях обычно проводят подготовительный цикл. В этом цикле через проточную ячейку прокачивается сначала раствор протеина, который оседает мономолекулярным слоем на поверхность золотой пленки. Потом прокачивают раствор тех биохимических молекул или антител, взаимодействие которых с молекулами или частицами аналита нужно изучить. Они присоединяются к протеину и образуют биорецепторный слой (лиганд). Эта процедура может длиться 1...2 ч. В цикле измерений проточная ячейка и чувствительная поверхность сначала промываются несколько минут буферным раствором ( рис. 23.8, фаза І). Потом через ячейку прокачивается заданный объем жидкости с исследуемым аналитом, и начинается измерение (фаза ІІ). Частицы аналита присоединяются к лиганду не сразу. Поэтому кривую ППР приходится измерять многократно, каждый раз рассчитывая по результатам измерений точное положение минимума ППР, и строить график его зависимости от времени. Этот график принято называть "сенсограммой". Всем этим автоматически руководит микропроцессор.

Рис. 23.8. Временная зависимость сдвига минимума ППР

Как видим из рис. 23.8, максимальная концентрация иммобилизованного (т.е. присоединенного к лиганду) аналита достигается лишь через несколько минут. Кинетика нарастания сдвига минимума ППР отображает кинетику химических реакций присоединения аналита к лиганду. Стационарное состояние, которое в конце концов устанавливается, является результатом динамического равновесия между химическими процессами присоединения и диссоциации (отсоединения) аналита и зависит как от констант соответствующих реакций, так и от концентрации аналита, температуры раствора, условий перемешивания и т.п. Это все можно исследовать.

В ходе следующей фазы (ІІІ) инжекция аналита прекращается, но продолжается прокачка чистой жидкости. Процессы присоединения практически прекращаются, идут лишь процессы диссоциации. Ход кривой на этой стадии позволяет вычислить константы этого процесса. А зная их, по результатам измерений в фазе ІІ можно вычислить и константы реакции присоединения. В фазе ІV через ячейку прокачивается раствор элюента, т.е. жидкости, которая, резко ослабляя химическую связь аналита с лигандом, постепенно "вымывает" аналит, практически не влияя на лиганд. И начинается регенерация биочувствительной поверхности, в ходе которой положение минимума ППР должно возвратиться к первоначальному. После этого можно начинать новый цикл измерений химического взаимодействия лиганда с другим или с тем же аналитом, но при других условиях. Практически удается провести свыше 50 разных исследований с одним и тем же лигандом.

Фирма Biacore AB выпускает и узко специализированные ППР сенсоры, как, например, BIACORE Quant, предназначенный специально для определения содержания витаминов.

Значительно более компактный интеллектуальный ППР сенсор SR7000 выпускает фирма Reichert Analytical Instruments, Inc. ( рис. 23.9) [http://www.reichertai.com]. В нем используется расходящийся световой пучок и линейка фотодетекторов, которые обеспечивают наблюдение ППР в пределах углов отражения от 58,5 до 85 .

Рис. 23.9. ППР сенсор SR7000 фирмы Reichert Analytical Instruments, Inc