Теоретические основы работы люминесцентных сенсоров. Хронофлуорометры

21.4. Обзор выпускаемых марок хронофлуорометров

В табл. 21.3 приведены данные об интеллектуальных сенсорах-хронофлуорометрах, выпускаемых сейчас для наблюдения и изучения процессов фотосинтеза.

Как видим, наиболее широкий выбор хронофлуорометров для исследований ИФХ предлагает ныне американская фирма Opti-Sciences. Фотографии этих интеллектуальных сенсоров показаны на рис. 21.8.

Наибольшим спросом в США пользуется хронофлуорометр OS5-FL, обеспечивающий наиболее широкие возможности. Источником действующего света регулируемой интенсивности является в нем твердотельный лазер с длиной волны излучения 685 нм. Модулированный "измерительный" свет излучает светодиод с узкополосным светофильтром на 690 нм.

При желании вместе с хронофлуорометром OS5-FL можно приобрести также источник модулированного "измерительного" света с длиной волны 450 нм. Импульсы "насыщающего" света регулируемой интенсивности дает 35-ваттная галогенная лампа тоже с узкополосным светофильтром на 690 нм. Для более тщательных опытов имеется также источник далекого красного (far-red) света с фильтром на 735 нм. Такой свет в период темновой адаптации способствует эффективному окислению пула пластохинонов, что позволяет корректно определить минимальный сигнал флуоресценции . Перед фотодиодом, который воспринимает флуоресценцию хлорофилла, установлен светофильтр, пропускающий лишь спектральную полосу от 700 до 750 нм. Частота модуляции может программно изменяться в ходе работы от 250 Гц до 40 кГц. Измерение интенсивности флуоресценции может осуществляться с интервалами времени от 0,2 мс до 2 с, которые тоже задаются программно. Продолжительность записи хронофлуорограмм – от 2 секунд до 45 мин. (по желанию – до 16 ч.). Объем памяти данных – 512 кбайт. Сенсор имеет ЖК дисплей 320x240 пикселей с подсветкой и 9 клавиш для взаимодействия с пользователем. В сенсор встроен источник автономного питания – аккумуляторная батарея на 12 В / 3,4 А-ч.

Рис. 21.8. Флуорометры для исследования ИФХ фирмы Opti-Sciences (США)

К сенсору OS5-FL можно приобрести такие аксессуары, как специальные кюветы для темновой адаптации, термостабилизации и для опытов с изменением температуры, кюветы для работы с водорослями и другие. В сенсор встроен привод 3,5-дюймовой дискеты, на которую можно переписывать полученные данные. Имеется внешний интерфейс RS-232. Размеры этого интеллектуального сенсора довольно значительны 280x180x130 мм, масса – 5 кг. Тем не менее, его относят к группе портативных.

Наименьшим, простейшим, наиболее дешевым и доступным является хронофлуорометр OS 30, во многом аналогичный описанному выше хронофлуорометру "Флоратест-1". Его размеры 190x100x50 мм, масса – 0,5 кг. В нем имеется лишь источник непрерывного света, который включается после периода темновой адаптации листка. ИФХ может регистрироваться с интервалами времени от 5 мкс до 0,1 с, которые задаются программно. Продолжительность отслеживания кривой ИФХ – от 2 с до 240 с. Память данных на 128 кбайт позволяет сохранять результаты до 4096 отсчетов.

Промежуточные характеристики имеет хронофлуорометр хлорофилла OS1-FL. По размерам (190x110x70 мм), он не намного больше хронофлуорометра OS 30, но масса его значительно больше, – 2 кг. Источник света и фотоприемник со светофильтром такие же, как и в OS5-FL. Однако нет источника действующего света, который должен приобретаться отдельно. Отсчеты интенсивности флуоресценции могут осуществляться с интервалами от 0,1 мс до 0,1 с, продолжительность наблюдения ИФХ – от 2 с до 45 мин.

Хронофлуорометр для водорослей AFM позволяет исследовать даже ИФХ микроводорослей. Он рассчитан на работу в паре с хронофлуорометром OS5-FL, с которым соединяется кабелем. Кроме параметров ИФХ, он позволяет дополнительно измерять еще и концентрацию микроводорослей в воде. Выпускается в виде стандартной и т.н. "ксеноновой" моделей. Сам хронофлуорометр OS5-FL с кюветой для водорослей позволяет исследовать ИФХ водорослей в концентрациях от 100 мкг/л. Стандартная модель AFM позволяет работать с водорослями, начиная уже от концентрации 10 мкг/л, а в паре с "ксеноновой" моделью – даже начиная от концентрации 0,1 мкг/л. В "ксеноновой" модели источником действующего света служит ксеноновая лампа с максимумом излучения на длине волны 450 нм, свет которой концентрируется на площади 1 см² боковой поверхности стандартной стеклянной кюветы с внутренним объемом 3 мл.

Волоконно-оптический хронофлуорометр GFP-Meter имеет набор светофильтров, позволяющих измерять флуоресценцию не только хлорофилла, но и родамина, флуоресцеина, ряда протеинов. Аналогичные возможности имеет и флуорометр GFL-1, который пригоден для работы в самых жестких полевых условиях.

Наиболее популярный сейчас в Европе хронофлуорометр РАМ-2100 фирмы Heinz Walz с основным блоком размерами 240x105x110 мм показан на рис. 21.9.

Рис. 21.9. Флуорометр РАМ-2100 немецкой фирмы Heinz Walz: а) основной блок, подставка, выносная головка, листок растения; б) флуорометр в действии; в) примеры хронофлуорограмм; г) увеличенное изображение подставки с галогенной лампой в действии

Источниками действующего ( AL ) и насыщающего ( SP ) света в нем служат матрицы светодиодов с длинами волн 655 нм и 735 нм (последние – для возбуждения фотосистем І) и миниатюрная галогенная лампа белого света. Эти источники света крепятся на специальной подставке. Измерительный модулированный свет излучается светодиодами на длине волны 655 нм в виде импульсов продолжительностью 3 мкс с частотой 600 Гц или 20 кГц. Амплитуда этих импульсов незначительна и практически не влияет на фотосинтетическую систему, но она достаточна для измерения индуцированных изменений интенсивности флуоресценции даже при прямом солнечном свете.

В памяти программ сенсора записаны программы стандартных экспериментов по индукции флуоресценции хлорофилла. Предусмотрена возможность для пользователей программировать свои варианты экспериментов, которые автоматически будет выполнять микропроцессор после нажатия клавиши "Пуск".

Флуорометр UV-A-PAM ( рис. 21.10) отличается тем, что имеет в своем составе дополнительный светодиод, излучающий ближний ультрафиолетовый свет (UV-A) с длиной волны 375 нм.

Рис. 21.10. Хронофлуорометр UV-A-РАМ-2100 фирмы Gademann Instruments Gmb

Такой свет поглощается в основном защитными пигментами (флаваноидами и др.), которые концентрируются преимущественно в эпидермисе листьев и защищают их внутренние структуры от значительных радиационных повреждений ультрафиолетовым излучением. Измеряя отношение интенсивностей флуоресценции хлорофилла при возбуждении ультрафиолетовым и при возбуждении сине-голубым светом, флуорометр рассчитывает концентрацию защитных пигментов, которая позволяет оценить стойкость растения против радиационных повреждений [ [ 14 ] , [ 84 ] ].